Обратная генетика, генная инженерия

Обратная генетика, генная инженерия

Подчеркнем еще раз, что определение нуклеотидной последовательности кодирующей области гена означает расшифровку аминокислотной последовательности кодируемого белка. А знание аминокислотной последовательности белка, в свою очередь, позволяет реконструировать его третичную структуру и доменную организацию. Является этот белок секреторным или внутриклеточным, может быть это трансмембранный белок, возможно,  он выполняет функции ионного канала или рецептора, или участвует во взаимодействии с другими белками, может быть он ассоциирован с ядром или митохондриями? Оказалось, что все эти и очень многие другие функции белков связаны с определенными, как говорят, конценсусными последовательностями аминокислот. И проводя сопоставительный компьютерный анализ, можно довольно точно реконструировать функции этого прогнозируемого белка. Вся эта дорога «от гена к белку» называется обратной генетикой.

Открытие любого гена всегда сопровождается изоляцией и клонированием его кодирующей области, так называемой молекулы комплементарной ДНК – кДНК. Для того чтобы определить, что такое кДНК, нужно вспомнить процесс транскрипции. Мы говорили,  транскрипция это  синтез  молекулы РНК, комплементарной определенным участкам молекулы ДНК, то есть генам. А есть процесс обратной транскрипции, когда в качестве матрицы используется молекула РНК и с помощью определенного фермента, который так и называется – обратная транскриптаза – производится синтез молекул ДНК. Если  взять какую-то специфическую молекулу мРНК и  провести обратную транскрипцию, получится очень важный класс молекул – комплементарная ДНК. Вы помните, в мРНК уже нет интронов, поскольку сплайсинг уже прошел. Поэтому обратный синтез ДНК с использованием в качестве матрицы мРНК позволяет получить молекулу кДНК, составленную только из экзонов, то есть представляющую собой кодирующую область соответствующего этой мРНК гена.

 

Рисунок 25. Получение комплементарной ДНК

На следующем этапе молекулу кДНК клонируют. Клонирование это очень эффективный метод поддержания и размножения любых относительно небольших молекул ДНК путем их встраивания в вектор и введения этой конструкции в клетки-хозяина – рис. 26.   Химерные молекулы, составленные из ДНК различного происхождения, называются рекомбинантными ДНК. Вектора обеспечивают проникновение чужеродных ДНК в клетки, и их конструируют на базе тех молекул, которым свойственно проникать в клетки, чаще всего вирусных или плазмидных ДНК. При этом стараются избавиться от собственных генов вирусов, чтобы вектор ни в коем случае не обладал инфицирующими свойствами. В качестве клеток-хозяина чаще всего используют бактериальные клетки.

 

Рисунок 26. Клонирование ДНК

Клонированную кДНК условно называют «ген в пробирке».  Эта система позволяет работать с геном как с веществом. Можно наращивать число копий гена путем размножения клеток-хозяина. Одновременно  могут быть обеспечены условия для экспрессии введенной в бактериальную клетку кДНК. Так, например, при клонировании генов человека в бактериях можно добиться синтеза в них чужеродных для этих клеток белков человека. Такая возможность, как мы уже указывали, определяется универсальностью генетического кода, то есть одинаковым прочтением информации, записанной в молекулах ДНК, клетками любого видового происхождения. Клонирование лежит в основе всей генной инженерии и, в частности, геноинженерного производства лекарственных препаратов, таких как инсулин, интерферон и многие другие.

После получения «гена в пробирке» определяют нуклеотидную последовательность клонированной кДНК. Процесс определения  нуклеотидных последовательностей ДНК называется секвенированием, а сами эти последовательности иногда называют сиквенсами. Методы секвенирования впервые были разработаны Сенджером, Максамом и Гилбертом в 1977 году. В настоящее время они значительно усовершенствованы и носят характер рутинной процедуры. Переход от  прогнозируемого или виртуального белка к реальному осуществляется путем получения антител либо к искусственно синтезируемым полипептидам, гомологичным прогнозируемой полипептидной последовательности, либо к продукту экспрессии кДНК в клетках-хозяина. ном человека»ект »

С помощью антител можно анализировать характер распределения этого белка in vivo в норме и при каких-то патологических состояниях, а также попытаться выделить его в количестве, достаточном для прямого биохимического анализа и выявления тех метаболитов, которые взаимодействуют с этим белком. Давайте задумаемся, что все это означает, если речь идет о заболевании, в этиологии которого есть генетическая составляющая? Идентификация подобного белка означает нахождение первичного биохимического дефекта при данном заболевании. Выделение этого белка и его биохимический анализ означает расшифровку первичной патологической метаболической цепи, то есть понимание молекулярных основ не только этиологии, но и начальных этапов патогенеза заболевания. А это, в свою очередь, создает базис для разработки не только симптоматических, но и патогенетических методов лечения заболевания – одно из главнейших направлений современной молекулярной медицины.

Подчеркнем  еще раз, что самая простая дорога к пониманию того, как устроены белки, лежит через гены. Вспомним, какие грандиозные усилия тратили ученые всего мира  еще 2-3 десятилетия тому назад на то, чтобы расшифровать аминокислотные последовательности наиболее просто устроенных белков или даже их фрагментов. Это методы физико-химического анализа, ядерно-магнитного резонанса, рентгено-структурного анализа, электронной микроскопии, масс-спектроскопии и др. Лучшие умы занимались этими вопросами в самых передовых хорошо оснащенных лабораториях. И успехи были достаточно скромные! Сейчас дела обстоят совершенно по-другому. Как только расшифровывается нуклеотидная последовательность кодирующей области гена, эта последовательность вводится в определенную компьютерную программу, которая вырисовывает соответствующий белок в объеме, в цвете, с указанием всех активных сайтов. Одновременно будет выписан список всех других белков по всему живому миру, которые имеют области гомологии с исследуемой аминокислотной последовательностью, и будет указано, какие функции эти белки выполняют. Таким образом, главнейшим следствием открытия гена является возможность перехода на белковый уровень анализа. В частности, открытие генов наследственных болезней человека создает методические предпосылки для изучения биохимических основ первичных патологических нарушений и разработки методов адекватной метаболической коррекции.

От работы с рекомбинантными ДНК и изучения последствий их введения в культуры клеток, то есть в системы in vitro, генная инженерия перешла на уровень экспериментальных животных и растений, то есть на системы in vivo. Этому способствовали успехи в области экспериментальной эмбриологии. Были созданы предпосылки для целенаправленного конструирования генетических модельных линий путем трансгеноза, то есть искусственного введения чужеродного генетического материала в оплодотворенную яйцеклетку или ранние зародыши экспериментальных объектов. Получающиеся в результате подобных манипуляций трансгенные линии животных или  растений являются идеальными экспериментальными системами для изучения функций отдельных генов и оценки их  биологического действия на организм, исследования молекулярно-генетических основ онтогенеза, а также возможности работы со специфическими клонами клеток in vivo.

На первых этапах трансгенные модельные линии получали путем прямых микроинъекций рекомбинантных ДНК в ядра оплодотворенных яйцеклеток. Одновременно была разработана методика получения зародышей-химер, состоящих из клеточных клонов, полученных из разных зигот. Если эти клетки различаются, например, по генам окраски шерсти, химерное животное будет иметь поперечную или пятнистую окрашенность. При этом животные, независимо полученные в результате объединения бластомеров двух разных линий, будут отличаться друг от друга по характеру пятнистости, так как процесс формирования клонов из разных клеток ранних зародышей носит случайный характер – рис. 27.

 

Рисунок 27. Химерные животные, различающиеся по гену окраски шерсти

Более прогрессивный способ создания трансгенных линий основан на использовании в качестве клеточных векторов эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). ЭСК получают из клеток бластоцисты (внутренней клеточной массы) или из первичных половых клеток ранних постимплантационных зародышей. Они обладают свойством тотипатентности, то есть способностью дифференцироваться  в любые специализированные типы клеток. Генетическую модификацию ЭСК проводят в условиях культивирования, а затем их вводят в бластоцель, где они могут случайным образом участвовать в формировании эмбриональных зачатков и органов развивающегося зародыша – рис. 28.

Значительный прогресс в изучении молекулярной природы наследственных болезней человека связан с возможностью конструирования и генетического анализа трансгенных линий мышей с сайт специфической модификацией определенного гена. Техника трансгеноза позволяет направленно разрушать гены и получать так называемые «нокаут»-линии, вводить специфические мутации в определенный ген, получать линии животных с гиперэкспрессией, тканеспецифической или эктопической экспрессией дополнительной введенной генетической конструкции. Генетические манипуляции могут быть проведены только в одной или нескольких специфических тканей экспериментального животного и даже в определенный момент дифференцировки. Подобные модельные линии мышей сконструированы практически для всех известных генов, ассоциированных с наследственными заболеваниями человека. Кроме того, подобные методические разработки заложили фундамент для развития генной терапии – лечения с использованием смысловых или регуляторных последовательностей ДНК.