ГЕНЕТИКА ВИРУСОВ

ГЕНЕТИКА ВИРУСОВ

 

Величайшие достижения середины XX века — откры­тие дискретных единиц наследственности (генов), разра­ботка хромосомной теории наследственности, развитие биохимической генетики микроорганизмов и установление принципа «один ген — один белок», открытие регуляции активности генов прокариотов Ф. Жакобом и Ж. Моно, открытие двойной спирали ДНК Дж. Уотсоном и Ф. Кри­ком и др., — создали основу для превращения генетики клас­сической в генетику молекулярную, где законы наслед­ственности и изменчивости изучаются на молекулярном и субмолекулярном уровнях.

 

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ВИРУСА

Вирусы являются одним из излюбленных объектов молекулярной генетики благодаря простому строению и малой молекулярной массе их геномов, которая в 106 раз меньше массы генома эукариотической клетки. Органи­зация генетического аппарата у ряда вирусов, например у SV40, настолько сходна с таковой генов эукариотичес­кой клетки, что получила название минихромосомы. Минихромосома широко используется для изучения орга­низации и репликации ДНК.

Число генов у вирусов значительно варьирует: от 3-4 генов у просто устроенных вирусов (парвовирусы) до 150 генов и больше у сложно устроенных (вирус оспы). Геном вирусов животных является гаплоидным, за ис­ключением ретровирусов, которые имеют диплоидный геном, представленный двумя идентичными молекула­ми РНК. У вирусов с фрагментарным геномом (вирусы гриппа, реовирусы) каждый фрагмент обычно представ­ляет собой один ген.

Так же, как и геном эукариотической клетки, ДНК-геном ряда вирусов животных имеет мозаичную структуру, при которой смысловые последовательности чередуются с неинформативными   последовательностями.   Механизм сплайсинга при формировании иРНК широко распростра­нен и среди вирусов, имеющих ядерную локализацию тран­скрипции (адено-, папова-, герпесвирусы), поскольку фер­менты, осуществляющие сплайсинг, находятся в ядре. Одна­ко сплайсинг был обнаружен и у РНК-содержащих вирусов. Например, у вирусов гриппа происходит сплайсинг транскриптов 7-го и 8-го генов; в результате сплайсинга и сдви­га рамки трансляции продуктами каждого из этих генов являются по два уникальных белка.

В составе генов ДНК-содержащих вирусов есть регуляторные участки, в том числе промотор, контролирую­щие функцию структурных генов. Сильными промоторами являются концы многих вирусных ДНК, представляющие собой длинные концевые повторы, сильный промотор име­ют гены тимидинкиназы вирусов оспы и герпеса. Эти промоторы используются в генной инженерии для усиле­ния транскрипции изучаемого гена.

 

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И НЕГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ

Взаимодействия между вирусами возникают в условиях смешанной инфекции, когда два вируса или более, родственных или неродственных, заражают одну и ту же клетку. Различают генетические и негенетические взаимодействия вирусов.

К генетическим взаимодействиям относят только те, в результате которых происходит обмен генетического материала, и возникают геномы, содержащие фрагменты обоих вирусов-родителей. К генетическим взаимодействиям относят множественную реактивацию, рекомбинацию, кросс- реактивацию, реассортацию и гетерозиготность.

Множественная реактивация. Вирусная инфекция мо­жет возникнуть при заражении клетки несколькими вирионами с поврежденными геномами вследствие того, что функцию поврежденного гена может выполнять вирус, у которого этот ген не поврежден. Этот феномен был вна­чале обнаружен на бактериофагах и получил название множественной реактивации. В основе множественной реактивации лежит кооперативный процесс, при котором вирионы с поражением разных генов дополняют друг друга путем генетической рекомбинации, в результате чего репродуцируется исходный неповрежденный вирус.

Эффективность множественности реактивации зависит от многих причин: степени повреждения генома вирионов, числа проникших в клетку вирионов, концентрации их в определенных  участках  клетки,   аутоинтерференции поврежденных вирионов. Для множественной реактивации важное значение имеет расстояние между вирионами с поврежденными геномами внутри клетки. Обработка ви­рионов двухвалентными ионами металлов, ведущая к их агрегации, усиливает множественную реактивацию.

Рекомбинацией называют обмен частями генома, включающей ковалентное встраивание участка (или участков) генома одного вируса в геном другого.

Под реассортацией понимают обмен геномными сегментами, когда не происходит ковалентного встраивания, и который возможен только у тех вирусов, чей геном представлен раздельными сегментами, каждый из которых включает один или несколько генов (вирусы с сегментированным геномом). Она наблюдается при генетических взаимодействиях меж­ду вирусами, имеющими сегментированный геном. Обра­зующиеся при этом гибридные формы вирусов называют реассортантами. Реассортанты вирусов гриппа получают при совместном культивировании вирусов с разными гена­ми гемагглютинина и нейраминидазы. В этом случае из общего потомства путем нейтрализации соответствующих антигенов можно выделить интересующие исследователя варианты.

Существуют определенные группировки (констелляции или созвездия) генов, которые в данной системе клеток более стойки и делают вирус более жизнеспособным.

Сходные процессы пересортировки генов имеют место у вирусов гриппа типов А, В и С и у других вирусов с фрагментарным геном — у буньявирусов, аренавирусов (однонитчатые РНК) и реовирусов (ротавирусов) (двунит­чатая РНК). Однако эти процессы не столь интенсивны и доступны изучению, как у вирусов гриппа.

Перекрестная реактивация. Перекрестная реактивация, кросс-реактивация или реактивация при скрещивании, происходит в том случае, когда у одного из штаммов вируса часть генома повреждена, а другой геном интактен. При смешанной инфекции двумя такими вирусами воз­можна рекомбинация неповрежденных участков генома инактивированного вируса с геномом интактного вируса, и в результате этого процесса появляются штаммы вируса со свойствами обоих родителей. Описываемый феномен также обозначается как «спасение маркера», поскольку реактивируется (рекомбинирует) лишь часть генома инактиви­рованного вируса, несущая какой-нибудь признак (мар­кер).

Гетерозиготность. При совместном культивировании  двух штаммов вируса может происходить формирование вирионов, содержащих в своем составе два разных генома или по крайней мере один полный геном и часть второго генома. Это явление названо гетерозиготностью.

Негенетическими взаимодействиями называют взаимодействия между белками разных вирусов (или с участием белков одного вируса и генетического материала другого вируса), не ведущие к наследуемым изменениям. При смешанной инфекции имеют место, как правило, и генетические и негенетические взаимодействия, причем последние могут принимать участие в генерации наследуемых перестроек генома, т.е. в генетических взаимодействиях. К негенетическим взаимодействиям вирусов относят комплементацию, фенотипическое смешивание и интерференцию.

Комплеменатацией называют взаимодействие белков разных вирусов в зараженной клетке, а также взаимодействие белков одного вируса с генетическим материалом (ДНК или РНК) другого, в результате которого репродукция вируса усиливается. Если ген одного из вирусов имеет мутацию, в результате которой соответствующий белок нефункционален, аналогичный белок другого вируса может восполнить недостающую функцию. Комплементация может быть неаллельной, межгенной, если каждый из двух вирусов имеет мутацию, которая не позволяет ему репродуцироваться в непермиссивных условиях, но мутации локализованы в двух разных генах, так что каждый вирус продуктом своего нормального, не имеющего мутации гена помогает вирусу-партнеру эффективно репродуцироваться. Возможна и неаллельная, внутригенная комплементация, в тех случаях, когда мутации у двух вирусов находятся в одном и том же гене, но в разных его участках, соответствующих разным доменам молекулы белка, кодируемого этим геном. Такая комплементация наблюдается в тех случаях, когда белок осуществляет свою функцию в виде олиго- или мультимера. Оба случая имеют место при комплементации между близкородственными вирусами. Комплементация возможна и между неродственными вирусами: например, вирусы-сателлиты (дельтавирус, аденоассоциированные вирусы и т.п.) способны к репродукции лишь в присутствии вируса-помощника.

Фенотипическим смешиванием называют формирование вириона, содержащего структурные белки двух вирусов. Вирусы, участвующие в фенотипическом смешивании, могут быть как близкородственными, так и неродственными. При фенотипическом смешивании гетерогенными, т.е. происходящими от разных вирусов, могут быть пепломеры в липопротеидной оболочке или капсомеры в капсиде. Частный случай фенотипического смешивания – транскапсидация, при которой геном одного вируса оказывается заключенным в капсид другого.

Интерференцией называют подавление размножения одного вируса другим. К негенетическим взаимодействиям обычно относят не опосредованную интерференцию (через индукцию интерферона или других факторов), а только ту, которая возникает при непосредственном взаимодействии вирусов, репродуцирующихся в одной клетке. К таким случаям относится подавление репродукции вируса дикого типа мутантом или холодо-адаптированным вариантом.

 

ОСНОВНЫЕ ПРОЦЕССЫ, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ НАСЛЕДСТВЕННОСТЬ И ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВИРУСОВ

Модификации. Модификациями называются не насле­дуемые (фенотипические) изменения у вирусов, обуслов­ленные клеткой-хозяином. Эти изменения лежат в основе адаптации вируса к новому хозяину и преодоления зави­симого от хозяина ограничения. Модификации нуклеино­вых кислот вирусов осуществляют клеточные ферменты, ответственные за ограничение (рестрикцию) репродукции вируса.

Мутации. В основе изменчивости вирусов лежат му­тации, т. е. изменения состава и последовательностей нуклеотидов вирусного генома. Мутации происходят у всех вирусов, независимо от того, является ли их генетическим аппаратом ДНК или РНК. В результате мутаций отдельные вирионы могут приобретать новые свой­ства. Дальнейшая судьба таких вирусов зависит от естественного отбора, сохраняющего популяцию, наиболее приспособленную к условиям существования. Мутации могут иметь разные последствия. В одних случаях они ведут к изменению фенотипических проявлений в нормальных условиях. Например, увеличивается или уменьшается размер бляшек под агаровым покры­тием; увеличивается или ослабляется нейровирулентность для определенного вида животных; вирус становится более чувствительным к действию химиотерапевтического агента и т. п. В других случаях мутация является летальной, так как вследствие ее нарушается синтез или функция жизненно важного вирусспецифического белка, например вирусной полимеразы.

В некоторых случаях мутации являются условно ле­тальными, так как вирусспецифический белок сохраняет свои функции в определенных, оптимальных для него, условиях и теряет эту способность в неразрешающих (непермиссивных) условиях. Типичным примером таких мутаций являются температурно-чувствительные (tempe­rature sensitive) — ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножения при повышенных температурах (39-42 °С), сохраняя эту способность при обычных тем­пературах выращивания (36-37 °С).

По своему механизму мутации могут быть тоже раз­ными. В одних случаях происходит деления, т. е. выпа­дение одного или нескольких нуклеотидов, в других слу­чаях происходит встраивание одного или нескольких нуклеотидов, а в некоторых случаях — замена одного нуклеотида другим. Мутации могут быть прямыми и обратными. Прямые мутации меняют фенотип, а обратные мутации — ревер­сии — его восстанавливают. Возможны истинные реверсии, когда обратная мутация происходит в месте первичного повреждения, и псевдореверсии, если мутация происходит в другом участке дефектного гена (интрагенная супрессия) или в другом гене (экстрагенная супрессия). Реверсия не является редким событием, так как ревертанты обычно более приспособлены к данной клеточной системе. Поэто­му при получении мутантов с заданными свойствами, например, вакцинных штаммов, приходится считаться с воз­можной их реверсией к дикому типу. Мутации носят случайный характер и объясняются статистическими законами.

В качестве физических мутагенов наиболее часто при­меняется ультрафиолетовое облучение, так как его энергия сопоставима с энергией химических связей. Реже приме­няются более жесткие виды облучения — рентгеновское и гамма-облучение, а также обработка вирусных суспензий нейтронами, протонами, электронами и ядрами гелия, так как они вызывают сильные разрушения вирусных геномов и их инактивацию.

В качестве химических мутагенов применяют аналоги оснований (бромурацил, бромдезоксиуридин, 2-аминопурин, нитрозогуанидин и пр.), алкилирующие и флуорес­цирующие соединения (профлавин), интеркалирующие агенты (актиномицин, этидин бромид), азотистую кислоту, гидроксиламин и многие другие.