ГЕПАДНАВИРУСЫ (СЕМ. HEPADNAVIRIDAE)

ГЕПАДНАВИРУСЫ (СЕМ. HEPADNAVIRIDAE)

Название семейства происходит от греч. hepar – печень и англ. DNA. Это семейство ДНК-содержащих оболочечных вирусов; представлено двумя родами: Orthohepadnavirus (от греч. orthos – правильный) и Avihepadnavirus (от лат. avis – птица).

Прототипным представителем семейства Hepadnaviridae и рода Orthohepadnavirus является вирус гепатита В (HBV), который инфицирует только человека и шимпанзе, поражая печень, в меньшей мере почки и поджелудочную железу. Впервые HBV был обнаружен под электронным микроскопом в 1970 г.Д. Дейном, получив название «частица Дейна».

Структура. Вирус гепатита В – сложноорганизованный, ДНК-содержащий вирус сферической формы, диаметром 42-47 нм. Он состоит из сердцевины (core), построенной по кубическому типу симметрии, состоящей из 180 белковых частиц, составляющих сердцевинный НВс-антиген, диаметром 28 нм, и липидной оболочки, содержащей поверхностный HBs-антиген. Внутри сердцевины находятся ДНК-полимераза, обладающая ревертазной активностью, протеинкиназа и концевой белок НВе-антигена (рис. 29).

 

Рис. 29. Строение вируса гепатита В.

 

ДНК-полимераза является полифункциональным ферментом, она вовлекается во многие функции жизненного цикла вируса: способна синтезировать новые цепи ДНК, на матрице как ДНК, так и РНК, обладая как полимеразной, так и ревертазной активностью. Нуклеазная активность деградирует РНК-цепь в гибриде РНК-ДНК.

Геном представлен двухнитевой ДНК кольцевой формы, у которой плюс-цепь укорочена на 1/3 длины. Вирусный геном записан на минус-цепи и состоит из 4 открытых частично перекрывающихся рамок считывания: Р, С, S и X. Рамка считывания Р кодирует вирусную полимеразу и терминальный белок, найденный на минус-цепи ДНК. Рамка считывания С кодирует структурные белки нуклеокапсида и НВе-антиген. Рамка считывания S кодирует вирусные поверхностные гликопротеины. Продукт гена Х усиливает транскрипцию гомологичных и гетерологичных клеточных генов, участвуя в процессе развития гепатоцеллюлярной карциномы.

Полноценная минус-цепь ковалентно связана с ДНК-полимеразой, которая достраивает плюс-цепь до полноценной структуры.

Репродукция. Прикрепление HBV к гепатоцитам определяется HBs-антигеном, который связывается с полимеризованным человеческим сывороточным альбумином и другими сывороточными белками, что облегчает взаимодействие вируса и мишени в печени. После проникновения сердцевины вируса (рис. 30, 1) в гепатоцит неполная нить ДНК-генома достраивается; формируется полная двунитевая циркулярная ДНК (рис. 30, 2), созревший геном (рис. 30, 3) попадает в ядро клетки. Транскрипция генома контролируется клеточными элементами транскрипции, находящимися в гепатоцитах. При транскрипции генома образуются четыре иРНК, включая иРНК-прегеном (рис. 30, 4), больший (3500 нуклеотидов), чем геном (3200 нуклеотидов). Прегеном кодирует HBe- и HBc-антигены, полимеразу и белковый праймер для репликации ДНК, а также является матрицей для репликации генома вируса. Информационная РНК перемещаются из ядра клетки в цитоплазму и транслируются с образованием белков вируса. Белки сердцевины собираются вокруг прегенома. Нуклеокапсид сердцевины содержит РНК-зависимую ДНК-полимеразу, имеющую активность обратной транскриптазы и рибонуклеазы. В результате синтезируется минус-нить ДНК (рис. 30, 5), после чего РНК разрушается действием рибонуклеазы, поскольку далее синтезируется плюс-нить ДНК на матрице минус-нити ДНК (рис. 30, 6). Оболочка вириона образуется на HBs-содержащих мембранах эндоплазматической сети или аппарата Гольджи (рис. 30, 7). Сформировавшийся вирион выходит из клетки

экзоцитозом.

Рис. 30. Репродукция вируса гепатита В.

 

Культивирование. Вирус гепатита В не культивируется на куриных эмбрионах, не обладает гемолитической и гемагглютинирующей активностью. Культивируется только в культуре клеток, полученной из ткани первичного рака печени в виде персистирующей инфекции, без оказания цитопатического и цитолитического действий и с малым накоплением вирионов. К вирусу чувствительны приматы: гориллы, шимпанзе, африканские зеленые мартышки.

Антигенная структура. В сердцевине вирионов находится ДНК-полимераза, НВе-антиген и НВс-антиген (антиген сердцевины). В свободном виде НВс-антиген не обнару­живается, он ассоциирован с частицей Дейна и выявляется в ядрах зараженных гепатоцитов. Напротив, НВе-антиген обнаруживается в свободном виде в крови обычно при на­личии HBs-антигена.

Впервые HBs-антиген был обнаружен в 1963 г.и описан в 1965 г. Блюмбергом, в крови австралийских аборигенов, поэтому получил название австралийского антигена. HBs-антиген обнаруживается в крови не только в составе вириона, но и в виде самостоятельных фрагментов. Помимо полноценных вирионов, частиц Дейна, в крови обнаруживаются пустые неинфекционные частицы диаметром 22 нм, сферической или филаментозной формы, состоящие из HBs-антигена как результат его избыточной продукции. Сферические и филаментозные пустые частицы неинфекционны, но высокоиммуногенны и индуцируют анти-HBs-нейтрализующие антитела. Присутствие HBs-антигена в крови свидетельствует об инфицированности организма вирусом. HBs-антиген обладает гетерогенностью, подразделяясь на 4 антигенных подтипа, имея общую антигенную детерминанту, обозначаемую как а, и две пары взаимно исключающих детерминант: d и y, w и r, образующих 4 главных подтипа: adw, ayw, adr и ayr, которые распространены в различных географических зонах. Связи между клиническим течением и подтипом не наблюдается. Защита против одного подтипа обеспечивает защиту и против других за счет наличия общей детерминанты.

Резистентность. Вирионы чувствительны к эфиру и детергентам. Необыч­ным свойством вирионов является устойчивость к высокой температуре: они выдерживают нагревание до 100 °С в те­чение 1-2 минут, при этом устойчивость к температуре повышается, если они находятся в сыворотке крови. После 10-минутного кипячения инфекционная активность вируса утрачивается, но антигенность сохраняется. Антигенность сохраняется при низких значениях рН (2,4). Инфекцион­ная активность и антигенность не утрачиваются при ульт­рафиолетовом облучении плазмы крови, хранении при температуре -20 °С в течение многих лет, повторном замораживании и оттаивании.

Этиология парентерального гепатита В. Гепатит В – одно из наиболее серьезных, широко распространенных заболеваний вирусной этиологии. Возбудитель относится к семейству  Hepadnaviridae, роду Orthohepadnavirus. Для него известно 8 генотипов (HBV-A, HBV-B, HBV-C…HBV-H), поражающих человека.

Эпидемиология. Вирус гепатита В передается восприимчивым лицам при контакте с кровью или другими жидкостями организма больных в острой стадии заболевания, но чаще с хроническими формами. Инфекция может возникнуть при введении крови или ее препаратов, при использовании нестерильных шприцев или игл (особенно у наркоманов), при гомосексуальных контактах, а также при гетеросексуальных контактах во время острой или хронической стадии инфекции. Возможна передача вируса от беременной матери к плоду путем трансплацентарной передачи вируса, либо во время родов и после родов, через молоко, слюну или сыворотку матери.

Важнейшими моментами эпидемического процесса при гепатите В являются: 1) длительное хроническое носительство; 2) вовлечение в эпидемический процесс лиц разного возраста; 3) наличие групп высокого риска заражения; 4) отсутствие сезонности заболевания.

Патогенез. Вирус проникает в клетки печени благодаря наличию на их поверхности специфических рецепторов, после разрушения наружных оболочек освобождается внутренний компонент, имеющаяся в его составе вирусная ДНК-полимераза достраивает недостающий участок плюс-цепи ДНК. Инфекция может проходить по одному из двух механизмов – продуктивному и интегративному. При продуктивном типе инфекции происходит транскрипция ДНК с помощью клеточных ферментов, образование иРНК, синтез вирусных белков. Репликация ДНК происходит по уникальному механизму с использованием в качестве промежуточной формы не ДНК, а РНК. Цикл репродукции оканчивается сборкой вирусных частиц в цитоплазме гепатоцитов с участием мембран ретикулоэндотелиальной системы. При интегративной инфекции после достройки второй нити ДНК происходит интеграция ДНК с клеточным геномом вблизи сильного промотора. В этом случае клетка начинает в огромном количестве производить HBs-антиген.

Клиническая картина. Инкубационный период острого гепатита В составляет от 45 до 180 суток (в среднем 90 суток). Чаще всего болезнь имеет циклическое течение. Преджелтушный период (продолжительность 1-4 недели) характеризуется постепенным началом. Появляется слабость, быстрая утомляемость, снижается работоспособность. Наряду с астеническими явлениями имеют место диспептические (ухудшение аппетита, тошнота, рвота). Повышение температуры тела нехарактерно. В этот период, как правило, увеличены печень и селезенка, а в конце его темнеет моча и светлеет кал.

Появление желтухи отмечают у 20-35 % больных остым гепатитом В. В желтушный период симптомы интоксикации, астенические и диспептические  явления достигают наибольшей выраженности, еще больше увеличивается печень и селезенка. Продолжительность этого периода колеблется в широких пределах, но к концу 1-го месяца у большинства больных желтуха исчезает, хотя у некоторых из них восстановительный период приобретает затяжной характер (до 6 месяцев).

Полное выздоровление регистрируют у 90-95 % больных острым гепатитом В и лишь у 5-10 % из них отмечают переход в хронический гепатит. У больных с безжетушной формой острого гепатита В клиническая симптоматика отличается скудностью, что не исключает возможности перехода острого гепатита в хронический.

При фульминантной (молниеносной) форме острого гепатита В в течение короткого периода времени (несколько суток) развиваются симптомы острой печеночной недостаточности и появляются признаки печеночной энцефалопатии. У 76 % больных с фульминантной формой острого гепатита обнаруживаются маркеры дельта-вирусной инфекции (вирус гепатита D). Часто эта форма гепатита В завершается летальным исходом.

У больных с хроническим гепатитом В нередко сохраняются умеренно выраженные симптомы интоксикации, слабая желтуха, гепатомегалия, ряд внепеченочных поражений.

Иммунитет. При заболевании формируется специфический иммунитет, который в большинстве случаев приводит к освобождению организма от вируса. Образование антител индуцируют три вирусных антигена – HBs, HBc и HBe. Основным антигеном, индуцирующим протективные антитела, является HBs-антиген. В период реконвалесценции обнаруживаются антитела ко всем трем антигенам. Показаетлем перенесенной острой инфекции являются анти-HBc и анти-HBe-антитела, в то время как анти-HBs-антитела могут обнаруживаться и у носителей.

Диагностика строится на определении ряда специфических маркеров гепатита В методом ИФА. Основным серологическим маркером перенесенной и хронической инфекции является HBs-антиген. Не менее важным является определение в крови HBe-антигена – маркера инфекционности (свидетельствует об активной репликации вируса). Кроме этих маркеров, широкое применение находит выявление ДНК вируса с использованием ПЦР и ПЦР в реальном времени с определением вирусной нагрузки, а также обнаружение специфических антител  методом ИФА. Из биохимических тестов используют определение в крови активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) и анализ уровня билирубина. Большое значение для диагностики и выбора терапии больных хроническим гепатитом В имеет исследование биоптатов печени.

Лечение. В терапии используют интерферон и ингибиторы ДНК-полимеразы.

Профилактика. Важнейшим и наиболее эффективным методом профилактики гепатита В является исключение попадания вируса при парентеральных манипуляциях, переливаниях крови. Для предотвращения предачи вируса половым путем принимают меры, аналогичные таковым при ВИЧ-инфекции.

Специфическая профилактика осуществляется вакцинацией в соответствии с национальным календарем прививок. Новорожденных детей (кроме родившихся у больных хроническим гепатитом В и носителей вируса) вакцинируют трижды по схеме 0-1-6 месяцев. Первоначально вакцину вводят в первые сутки жизни ребенка, повторно – через месяц и третий раз – в возрасте 6 месяцев (одновременно с третьей прививкой против коклюша, столбняка, дифтерии, а также полиомиелита). Третья иммунизация против гепатита В важна для достижения высокой концентрации специфических антител и длительного (до 10 лет) их сохранения. Осуществление такой схемы иммунизации позволяет эффективно предупреждать возможное перинатальное инфицирование.

Детей, родившихся у женщин с хронической инфекцией, острым гепатитом В в III триместре беременности, носителей вируса вакцинируют 4 раза по схеме: 1-е сутки жизни, 1-2-12 месяцев. У этих детей, имеющих наиболее реальный риск инфицирования вирусом при прохождении родовых путей, важно своевременно ввести вакцину (в первые 12-24 ч жизни). Четырехкратная иммунизация позволяет в наиболее ранние сроки достичь у них появления в крови анти-HBs в защитной концентрации и тем самым предупредить развитее инфекционного процесса.

В РФ в настоящее время распространены рекомбинантные вакцины против гепатита В на основе HBs-антигена, экспрессируемого дрожжами: «Engerix B» фирмы «GlaxoSmithKline», «Эувакс В» фирмы «Санофи Пастер», H-B-VAX II фирмы «MERCK & CO.», отечественная вакцина производства «Комбиотех» и «НПО «Микроген». Также применяют комбинированные вакцины: «Бубо-Кок» — комбинированная вакцина для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и вирусного гепатита В и «Бубо-М» — комбинированная вакцина против дифтерии, столбняка и гепатита В производства «Комбиотех».

Препараты, применяемые для специфической профилактики гепатита В.

Вакцина гепатита В рекомбинантная, дрожжевая, жидкая

Вакцина гепатита В представляет собой полученный генно-инженерным методом поверхностный антиген вируса гепатита В подтипа ayw, наиболее распространенного в России (95-98 %). Вакцина выпускается по 1 мл с содержанием HBs-антигена  20 мкг (взрослая доза) и 0,5 мл с содержанием HBs-антигена 10 мкг (детская доза). Консервант – мертиолят в концентрации менее 0,005 %.

Участок гена вируса гепатита В, кодирующий HBs-антиген, встраивается в ДНК дрожжевой клетки, а вакцина против гепатита В производится из культуры рекомбинантного дрожжевого штамма.

Вакцина относится к ayw подтипу. Антиген собирается и очищается от ферментативных культур рекомбинантного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, содержащих ген, кодируемый ayw подтип HBs-антигена. Белок HBs высвобождается из дрожжевых клеток путем их разрушения и очистки с помощью различных физических и химических методов. Полученная таким методом вакцина не содержит определяемых количеств дрожжевой ДНК и содержит менее 1 % дрожжевого белка. Защитный эффект вакцины, производимый по описанному методу, у шимпанзе и человека сопоставим с таковым вакцины, полученной из плазмы.

Вакцина против гепатита B, изготовленная из рекомбинантных дрожжевых культур, не содержит человеческую кровь или ее продукты.

Каждую серию вакцины против гепатита B проверяют на безопасность на мышах и морских свинках на стерильность.

Применяется для:

— иммунизации против инфекции, вызываемой всеми известными подтипами вируса гепатита B;

— иммунизации против гепатита D, вызываемого дельта-вирусом (гепатит D не развивается при отсутствии гепатита B);

— вакцинации взрослых пациентов перед началом лечения гемодиализом или во время него против всех известных подтипов вируса гепатита В (лекарственная форма для больных, находящихся на диализе).

Для оптимальной защиты от инфицирования вирусом гепатита В рекомендуется назначать по крайней мере 3 инъекции вакцины. Первые две инъекции могут рассматриваться как начальные дозы, в то время как третья или дополнительные инъекции служат для усиления выработки антител у предварительно вакцинированных пациентов или сероконверсии у небольшого числа пациентов, у которых снижен иммунный ответ на антиген вакцины.

Время назначения последующих инъекций может быть выбрано в соответствии с поставленными целями:

1-я инъекция – выбранная дата;

2-я инъекция – через 1 или более месяца после 1-й инъекции;

3-я инъекция – через 1 или более месяца после 2-й инъекции.

Интервал между двумя инъекциями вакцины должен быть не менее 1 месяца. Ускоренные режимы (например, 0, 1, 2 месяца; 0, 2, 4 месяца) могут вызвать более раннее образование защитных антител у несколько большего числа пациентов. Однако при использовании режимов с более продолжительным интервалом между 2-й и 3-й инъекциями (например, 0, 1, 6 месяца; 0, 1, 12 месяца) сероконверсия в конечном итоге происходит у такого же количества пациентов, однако титр антител оказывается существенно более высоким, чем при назначении ускоренных режимов вакцинации.

Выпускается по 1 мл (1 взрослая доза) или по 0,5 мл (1 детская доза), в ампулах, по 10 ампул в блистерной упаковке.

Вакцину следует хранить при температуре 2-8 °C.

Срок хранения всех форм препарата – 3 года.

«Бубо-Кок» — комбинированная вакцина для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и вирусного гепатита В

Представляет собой комбинацию рекомбинантного дрожжевого поверхностного антигена вируса гепатита В и смесь убитых формалином коклюшных микробов и очищенных от балластных белков дифтерийного и столбнячного анатоксинов (АКДС), адсорбированных на геле алюминия гидроксида.

Препарат содержит в одной прививочной дозе (0,5 мл) 5 мг HBs-антигена, 10 оптических единиц (ОЕ) коклюшных микробов, 15 флокулирующих единиц (Lf) дифтерийного и 5 единиц связывания (ЕС) столбнячного анатоксинов. Консервант – мертиолят в концентрации 0,01 %. Гомогенная суспензия желтоватого цвета, разделяющаяся при стоянии на бесцветную прозрачную жидкость и рыхлый осадок желтовато-белого цвета, легко разбивающаяся при встряхивании.

Введение препарата в соответствии с утвержденной схемой вызывает формирование специфического иммунитета против коклюша, дифтерии, столбняка и гепатита В. Проведенные исследования показали, что вакцина Бубо-Кок характеризуется безопасностью и высокой иммунологической активностью.

Прививки вакциной Бубо-Кок проводят в возрасте от 3 месяцев до достижения 4 лет. Препарат вводят внутримышечно в верхний наружный квадрант ягодицы или в передненаружную область бедра в дозе 0,5 мл (разовая доза) трехкратно по схеме вакцинации АКДС.

Курс вакцинации состоит из 3-х прививок (3-4-5 месяцев).

Ревакцинация Бубо-Кок проводится в 12-18 месяцев однократно. Исключение должны составить дети, рожденные от HBs-антиген-позитивных матерей. Таких детей следует прививать в первые дни жизни рекомбинантной моновакциной гепатита В.

Выпускается в ампулах по 0,5 мл (прививочная доза). Упаковка содержит 10 ампул.

Срок годности препарата – 1 год 6 месяцев.

«Бубо-М» — комбинированная вакцина против дифтерии, столбняка и гепатита В

Применяется для профилактики гепатита В, дифтерии и столбняка у детей старше 6 лет, подростков и взрослых.

Бубо-M вакцину применяют:

— при проведении курса вакцинации детям старше 6 лет, ранее не привитым против дифтерии, столбняка и гепатита В;

— для плановых возрастных ревакцинаций (по схеме применения АДС-М) детей старше 6 лет, подростков и взрослых, ранее не привитых против гепатита В;

— при совпадении сроков ревакцинации детей и подростков против дифтерии и столбняка с одной из прививок курса вакцинаций вакциной гепатита В.

Представляет собой комбинацию рекомбинантного дрожжевого поверхностного антигена вируса гепатита В (НBsAg) и очищенных от балластных белков дифтерийного и столбнячного анатоксинов (АДС-М) адсорбированных на геле алюминия гидроксида.

Препарат содержит в одной прививочной дозе (0,5 мл) 10 мкг HBsAg, 5 флокулирующих единиц (Lf) дифтерийного и 5 антитоксинсвязывающих единиц (ЕС) столбнячного анатоксинов, мертиолят (консервант) 25 мкг. Мутная жидкость, при отстаивании разделяющаяся на два слоя: верхний – бесцветная прозрачная жидкость; нижний – осадок желтовато-белого цвета, легко разбивающийся при встряхивании.

Введение препарата в соответствии с утвержденной схемой прививок вызывает формирование специфического иммунитета к вирусу гепатита В и антитоксического иммунитета против дифтерии и столбняка.

Выпускают вакцину в ампулах по 0,5 мл (1 прививочная доза) или по 1 мл (2 прививочные дозы). Упаковка содержит 5 или 10 ампул.

Срок годности – 3 года.